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常见问题

第一部分   如何提取高质量RNA?

1. 迅速灭活内源的RNA酶,以防止RNA降解。
以下3个方法均可有效使内源RNA酶失活:
1)用含离液(如胍盐)的细胞裂解液收获样品,并立即匀浆。
2)用液氮瞬间冻结样品。值得特别注意的是:组织块必须保证足够小,在浸入液氮的瞬间就能冻结,以确保瞬间令RNA酶失活。
3)立即将样品置于RNAfixer无液氮RNA样品储存液中。它是一种水相、无毒的收集试剂,能立即稳定并保护完整、未冻结的组织和细胞样品中的RNA。关键要点是组织样品切片一定要够薄(<0.5 cm),这样RNAfixer才能在RNase破坏RNA之前迅速渗入组织块中。
2. 使用正确的细胞或组织储存条件
在样品用液氮瞬间冻结之后,应该储存在-80°C,千万不能解冻。即使是置于含有胍盐的裂解液中作匀浆前的短暂解冻,也会导致RNA的降解和损失。瞬间冻结的组织应该首先在超低温条件下先研磨成粉,然后置于裂解液中进行匀浆。

RNAfixer使样品储存更为便利。储存在RNAfixer中的细胞或组织可在室温下稳定保存长达1个星期,在4°C可稳定保存长达1个月,或永久保存在-20°C。RNAfixer说明书下载.
3. 破壁方法
细胞或组织的彻底匀浆对RNA提取来说,是一个很关键的步骤,它能够防止RNA的损失和降解。匀浆的方法应根据细胞或组织的类型来选择。大部分培养的细胞可以置于细胞裂解液中,通过简单的涡旋震荡来匀浆;而动物组织、植物组织、酵母和细菌、真菌则常常需要更加剧烈的方法,通常用液氮研磨。比如说细菌(特别是革兰氏阳性菌)的细胞壁,就需要溶菌酶消化来实现彻底的细胞裂解和RNA的最大回收。酵母和革兰氏阳性菌通常还需要液氮研磨过程中加入玻璃微珠帮助破壁,酵母提取也可以加入诸如Lyticase等破壁酶帮助破壁,再用TRIpure或RNApure进行提取。
4. 选择最好的RNA分离方法
现有众多的RNA分离方法也许令人难以取舍。目前最简单也是最安全的方法是柱式分离,如RNApure 因为操作简单,时间短,纯度高而受到大家的喜爱,RNApure不需要DNA酶消化DNA,节省了时间,避免RNA的降解,从而提高了产量;相对非柱式分离(如TRIZOL),去除蛋白及其他杂质干净,提高了纯度,对于细胞、组织、一般植物均非常适合。植物RNA的提取比较难抉择,植物RNA提取受酚、多糖、蛋白杂质、次生代谢物含量的影响,一般用TRIZOL提取纯度不高,而且很多植物用TRIZOL提取不出来。这时候可以选择多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(水仙、辣椒、胡萝卜、玉米、百合、小麦、西红柿、花菜、油菜等)和通用植物RNA提取试剂盒(适合绝大多数植物提取,包括:苹果、葡萄、草莓、香蕉、龙眼、荔枝、草坪植物、松树、杉树、白桦、紫松果、彩叶草、一品红、夹竹桃、垂叶榕、紫罗兰、月季、天竺蓝、牵牛花等);非常值得一提的是血液(包括血清、血浆、脑脊液、其他液体)RNA的提取用TRIZOL和红细胞裂解的方法效果都不好,红细胞裂解液不含有RNA酶的抑制成分,这个过程RNA很容易降解,推荐使用TRIpure LS 或者血液总RNA提取试剂盒。
5. 消除环境RNase的污染
为了得到完整的、高品质RNA,在整个RNA制备过程中,当RNA离开强蛋白变性剂(如离液裂解液或酚)的保护时,避免引入新的RNase污染就非常关键。由于RNase几乎是无所不在,所以必须确保与纯化的RNA接触的每一样东西都是无RNase污染的。所有的表面,包括移液器、工作台、玻璃器皿和制胶设备,都必须用表面去污净化溶液如RNase喷雾清除剂 来处理过,去除各种溶液或者反应缓冲液中可能存在的RNase污染,可以用RNAsafe。必须保证一直使用无RNase的枪头、试管和溶液,手套也应经常更换。
6. 低浓度RNA的沉淀
纯化得到的RNA可能需要通过沉淀来浓缩,以满足一些下游应用的需要。醋酸铵(NH4OAc) 沉淀(加0.1体积的5 M 醋酸铵、2-2.5体积的无水乙醇,-20°C放置25分钟以上)可以很好地回收RNA。如果需要定量回收低浓度的RNA(ng/ml),可以采用共沉淀(如linear acrylamide糖原glycogen,、酵母yeast RNA )的方法。核酸助沉剂是linear acrylamide,当RNA用于RT-PCR分析时,线性的丙烯酰胺和DNase处理的糖原都可以作为理想的共沉淀剂,因为它们都不含DNA污染,糖原含量高会抑制PCR反应。酵母RNA和未处理的糖原会给样品带来核酸污染,有可能影响RT-PCR的结果。沉淀后,注意避免RNA沉淀过分干燥,因为这可能导致很难重新溶解。
7. 提取好的RNA如何储存
如果只是短期储存,重悬的RNA应放置于-20°C;如果是长期储存的话,就应该放置于-80°C。尽管重悬于水或缓冲液中的RNA也可以储存在-80°C,但保存RNAlong中的RNA沉淀则更加稳定,可以长期保存。我们推荐将RNA溶液分装在几支管中。这会避免反复冻融损伤RNA,并预防偶然的RNase污染。

第二部分  有关UltraPower染料无毒证明的问题
1、 UltraPower是否有无毒证明或者官方证书?
在国内花钱就能拿到无毒证明,意义不大,比如GOLDVIEW,事实证明是吖锭橙,波长和吖锭橙一样,见网站:http://www.ope-tech.com/doc/GelRed.asp
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2、 花菁染料毒性是非常低的,可以忽略不计。
这个可以问做化学的,网上资料也很多,比如DVD的染料层就有花菁(Cyanine)、钛菁(Phthalocyanine),http://zhidao.baidu.com/q?ct=17&pn=0&tn=ikaslist&rn=10&word=%BB%A8%DD%BC%C8%BE%C1%CF&fr=wwwt。3、 如何证明UltraPower是花菁染料?
花菁染料的激发和发射波长都在可见光区,可以用可见光凝胶透射仪观测,而且灵敏度比在紫外光区更高,诸如GOLDVIEW、GELRED都不能用可见光激发,不是花菁染料。
4、 诸多文献证明,核酸暴露在紫外光下,突变概率大大提高。
紫外光是一种核酸诱变剂,曾用在育种,工程菌株基的筛选等方面。长期处于UV环境,对于操作者也会造成一些影响。所以用可见光凝胶透射仪是最佳选择,可以避免UV伤害。
5、 有没有毒性都是相对的,我们说没有毒性是相对于EB的。
不能要求这是食品级的。操作过程中,我们建议按照实验室工作标准进行,比如穿工作服,戴手套等。

第三部分 Real-time qPCR 常见问题分析
1. 做标准曲线时候,可否用2个不同体系浓度的稀释分别对于内参和目的基因?
建议最好用同样稀释倍数做曲线,因为模板浓度会影响扩增效率。
2. 熔解曲线中,Tm不出现在80度左右?
扩增片段100bp左右的,一般应该出现在80度左右。如果低于此温度出现,可能是模板降解。
3. 扩增曲线没有Ct值,仅仅一条斜线?什么原因?
模板浓度过低或者模板降解。
4. ROX 校正为何可以导致熔解峰的不专一?
ROX也是一种荧光染料,会有荧光的发生。
5. 如果内参和目标基因表达量差别比较大,也就是目的基因的表达量少,
Ctcon=15,Cttarget=38,可否应用?
可以用于数据分析。因为表达量低,从而用过高模板进行扩增,从而同内标的模板不同,反而会增大数据统计的误差。
6. 引物浓度可否是50nM,是否太低?
如果扩增曲线和熔解曲线比较好,这个浓度当然可以。如果更低,扩增结果好的情况下,同样可以运用。
一句话,所有的模板、引物等浓度尽量不要用高的,会影响扩增效率。
7. miRNA多个扩增时候,如果一个的扩增效果比较,其它熔解曲线不止一个峰,如何解决?
Primer对于miRNA是专一的。所以重新设计引物是不可取的。那么只能是提高Tm或者更换mastermix等。反应体系会影响反应产物的。
8. miRNA反转录引物和定量方法?与mRNA发转录及real-time PCR有和区别?
一般常用的反转录primer有2种,一种是step-loop的primer;一种是首先3末端加A,然后ployT再发转录。
用于real-time qPCR的上游primer都是针对miRNA结构本身的;下游有个通用primer。定量可以用SYBR Green I,也可以用Taqman。
9. 相对定量方法,如果用Ct值比较,是各个样品平均后在2delt Ct还是分别2 delt Ct在平均比较好?
相对定量的方法各有优缺点,主要取决于实验的目的和材料的准备。如果是材料群体个体差异不大,这2种方法基本没有很大的区别;如果是个体差异比较大,建议用双标准曲线做。就是分别做内参和目的基因的标准曲线,分别带入Ct值计算。
10. 熔解程序可否不加?
如果是扩增效果好,特异扩增,可以不加熔解程序;但建议做好加上。
11. 扩增反应体系5μL,扩增效率低,什么原因?
反应体系小,各种因素的影响比较大,比如引物浓度、模板浓度及其金属离子等会影响扩增效率的。
12. 如何减少非特异性扩增的干扰?
设计一对好引物,提高primer的退火温度,以及设定吸光温度。

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