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PCR不必“摸条件” 

PCR是分子生物学科研人员必做的实验,为了扩增目的基因,经常要对PCR的体系进行“摸条件”,特别是一些GC含量高的目的基因或者DNA纯度不高的样本! “摸条件”成为PCR实验最费时费力的工作!虽然市场上有很多PCR的MasterMix试剂,将酶、dNTP、反应缓冲液混合在一起,很方便客户的使用,但仅仅是简单的混合,极少公司对MIX的应用范围进行广泛的实验和优化,只能做一些不复杂的PCR。
百泰克通过长时间、无数次的实验优化,终于推出了适用范围广、稳定性良好的PCRMIX,是目前最“傻瓜”的PCR反应体系之一,不论是质粒、菌液、CDNA、基因组DNA、或者是直接裂解的粗提物,GC含量高达75%的模板,都能轻松扩增,不需要费力的“摸条件”!
本产品包含酶、dNTP、特殊稳定剂和优化的反应缓冲液,浓度为2x。DNA扩增时,只需加入模板,引物和水,使MasterMix溶液的浓度为1×即可进行反应。具有快速、灵敏度高、特异性强、稳定性好等优点。进行PCR扩增可以减少操作时间,避免因多步操作带来的污染,特别适宜高通量筛选基因的扩增 ,Taq PCR MasterMix扩增产物可用于T/A克隆。本产品加入特殊稳定剂,37 ℃温度下48 h仍然保持95%以上的扩增效率.储存条件: -20 ℃一年有效,多次冻融不会影响活性,经常使用可放置于4 ℃。
本品为适应大部分PCR反应需要,Taq 酶量是按照PCR反应酶量上限所加,如出现PCR反应非特异性扩增明显或者背景过高,可将Taq PCR MasterMix反应液适当稀释后使用,可改善PCR扩增效果。
PCR反应液:

组成成分 50 uL体系
2X MasterMix 25 uL
上游 Primer(10 uM) 1-5 uL
下游 Primer(10 uM) 1-5 uL
模板:lamid DNA ~50 ng?
genomic DNA ~1000 ng
cDNA ~500 ng
粗提液 ~2 uL
灭菌蒸馏水至 50 uL

PCR扩增实例: 
 plasmid DNA扩增: 
1.提取的质粒DNA扩增 
以pUC19质粒为模板扩增100,250,500,1000,2000 bp片段,以pBS质粒为模板扩增1500 bp片段。
1

 

模板:pUC19质粒30 ng/50 μL or pBS质粒30 ng/50 μL
PCR扩增程序


循环数

Step

温度

时间

1

1

94 ℃

2 min

35

1

94 ℃

45 sec

2

55 ℃

45 sec

3

72 ℃

2 min

1

1

72 ℃

5 min

2.质粒菌液直接扩增: 
以pUC19菌液为模板扩增100,250,500,750,1000 bp片段,以pBS菌液为模板扩增1500 bp片段。
1
模板:菌液OD600=0.8时2 μL /50 μL 
PCR扩增程序:同上a扩增程序同。

结果:Bioteke 2×power Taq PCR MasterMix试剂对于质粒或菌液均可高效率的扩增。取扩增产物10 μL用1%琼脂糖凝胶电泳进行分析可见明亮条带。

二.genomic DNA扩增 
1.大肠杆菌DNA扩增 
1

模板:大肠杆菌DNA 50 ng/50 μL
PCR扩增程序


循环数

Step

温度

时间

1

1

94 ℃

4 min

  
35

1

94 ℃

45 sec

2

58 ℃

45 sec

3

72 ℃

1.5 min

1

1

72 ℃

5 min

2.高GC含量的片段扩增 
a.人类基因组扩增(GC含量>60%) 
1
模板:人类基因组 100 ng/50 μL
Primer:PrimerF:5′-GGGAGGGGACCGGGGAACAGAG-3′
PrimerR: 5′-GAACAGTCCGTCACTTCACGTG-3′
PCR扩增程序


循环数

Step

温度

时间

1

1

94 ℃

4 min

  
35

1

94 ℃

45 sec

2

60 ℃

45 sec

3

72 ℃

1.5 min

1

1

72 ℃

5 min

b.菌Streptomyces phaeochromo gene的片段扩增(GC含量>70%) 
提取菌Streptomyces phaeochromo gene进行PCR扩增
1

模板:菌Streptomyces phaeochromo gene 100 ng/50 μL
Primer:71%GCPrimerF:5’-CCACCGGCCGCAGAGCAC-3’
71%GCPrimerR:5’-AGACGAGTCCCTTGGTTGGTAGC-3’
74.3%GCPrimerF:5’-CTCATCGTCGGCGCCGTCCTGGTC-3’
74.3%GCPrimerR:5’-CGGTCGGCTCGCTCCTGCTCTTCC-3’
PCR扩增程序


循环数

Step

温度

时间

1

1

94 ℃

4 min

  
35

1

94 ℃

45 sec

2

55 ℃

45 sec

3

72 ℃

1 min

1

1

72 ℃

5 min

结果:可见Bioteke 2×power Taq PCR MasterMix试剂对于原核或真核生物DNA均可高效。相较于同类的taq mix的扩增效率更高,且对于高GC含量也可得到很好的扩增。取扩增产物10 μL用1%琼脂糖凝胶电泳如图可见明亮条带。

 cDNA扩增 
人类胎盘提取的总RNA反转录的cDNA扩增1.2 kbp片段
1
模板:人类胎盘提取的总RNA反转录的cDNA 200 ng/50 μL
Primer: PrimerF:5’-ATGGGCCTGGACATACAGAGCCTGGACA-3’
PrimerR:5’-ATTCGGAGATGACCCTCAGGGATGGCTT-3’
PCR扩增程序


循环数

Step

温度

时间

1

1

94 ℃

2 min

  
35

1

94 ℃

45 sec

2

62 ℃

45 sec

3

72 ℃

1 min

1

1

72 ℃

5 min

结果:取扩增产物10 μL用1%琼脂糖凝胶电泳可见清晰条带。

 粗提液扩增 
1. 人类头发粗提液扩增 
对人类头发及血液等进行扩增时,通常的做法是将头发中的DNA抽提出来再进行基因分析,但该方法的DNA纯化步骤非常烦杂。这里探讨将头发经过裂解后直接作为样品的扩增实验。 
操作流程:将采集到的1根男性毛发毛囊用70%乙醇洗涤一次;用蒸馏水冲洗毛发两次;在PCR管中加入15 μL裂解液65 ℃ 30 min,95 ℃ 15 min;将PCR管短暂离心,取4 μL裂解产物作为模板进行扩增 
1
模板:人毛发粗提液4 μL
Primer: PrimerF:5’-TCCACTTTATTCCAGGCCTGTCC-3’????????? 
PrimerR:5’-TTGAAATGGAATGGGAACGAATGG-3’??? 
PCR扩增程序


循环数

Step

温度

时间

1

1

94 ℃

4 min

  
35

1

94 ℃

30 sec

2

55 ℃

30 sec

3

72 ℃

30 sec

1

1

72 ℃

5 min

2. 植物粗提液的扩增 
部分实验室里经常进行植物的实验,从植物中抽提DNA作为样品进行PCR分析是个很繁杂而且费时的过程。在这里探讨用简便的一步法将植物组织处理后取其上清作为模板进行扩增分析的方法。 
操作流程:截取1-2片0.5-0.7 cm的小麦叶片放入1.5 mL 离心管中,加入100 μL溶液L,确保叶片浸没在溶液中;95 ℃ 10 min;加入100μl溶液I;Vortex混合。取2 μL做模板扩增。 
1
模板:植物粗提液2 μL
PCR扩增程序:同毛发程序同。

结果:采用本方法,以人毛发及小麦的粗提液为模板扩增,取扩增产物10 μl用1%琼脂糖凝胶电泳可确认到明亮的条带。