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如何评判荧光定量试剂质量

荧光定量PCR试剂对比实验结果(4月22日)

地点:中国农科院重大工程楼107

为检验BioTeke公司实时荧光定量试剂(SYBR GreenⅠ)质量,本次实验分别采用国际知名的ABI公司(ABI Power SYBR Green PCR Master Mix)、TOYOBO公司(Realtime SYBR GreenⅠPCR Master Mix)和BioTeke公司产品进行实时荧光定量PCR分析,实验过程中除了荧光定量试剂Mix不同,其它反应条件(模板、引物和反应体系等)均一致,所用荧光定量PCR仪型号为ABI7000。
实验材料
小鼠肝脏组织
实验方法
RNA提取:RNApure高纯总RNA提取试剂盒(BioTeke),操作步骤参照说明书。目的基因:小鼠管家基因β–actin.。
cDNA制备:测定小鼠肝脏总RNA浓度,而后使用Super RT Kit(BioTeke) 制备20μl cDNA。操作参照试剂盒说明书。
二步法荧光定量PCR:
BioTeke 2×SYBR real-time PCR premixture Kit. 20μl反应体系:
2×SYBR premixture 10μl
RNA Free Water 8.2μl
Primer F 0.4μl
Primer R 0.4μl
cDNA 1μl
ABI Power SYBR Green PCR Master Mix Kit 20μl反应体系:
2×SYBR premixture 10μl
RNA Free Water 8.2μl
Primer F 0.4μl
Primer R 0.4μl
cDNA 1μl
TOYOBO Realtime PCR Master Mix(SYBR Green) Kit 20μl反应体系:
2×SYBR premixture 10μl
RNA Free Water 8.2μl
Primer F 0.4μl
Primer R 0.4μl
cDNA 1μl

备注:每份试剂均做三管重复。

反应程序:
95℃ 10min
95℃ 15sec
61℃ 31sec
40个循环

实验结果
小鼠肝脏组织RNA反转录成cDNA后分别用BioTeke公司试剂、ABI公司试剂和TOYOBO公司试剂同时进行两步法荧光定量PCR扩增结果如图1。

1

从三家公司试剂的扩增曲线(图1a)可看出,在相同反应情况下BioTeke公司试剂的Ct值最小,TOYOBO公司的Ct值次之,ABI公司试剂的Ct值最大;另外,不同试剂的荧光信号值,BioTeke公司的最高,TOYOBO公司与ABI公司的大致相当,从这些结果可以说明,BioTeke 2×SYBR real-time PCR premixture Kit具有较高的扩增效率。
从熔解曲线(图1b)可以看出,ABI公司试剂和TOYOBO公司试剂与BioTeke公司相比熔解曲线峰值较低,也同样反应出扩增效率高低的问题。另外两家公司试剂的熔解曲线峰值重复性较差,反应特异性不好,建议引物重新设计。

实验结论
经过实验对比可看出BioTeke公司的2×SYBR real-time PCR premixture Kit是三家公司中扩增效率最高、特异性最好的,并且比ABI公司的Power SYBR Green PCR Master Mix具有更高的扩增效率,更好的特异性。说明,BioTeke公司的试剂质量绝不亚于国际知名公司的产品。