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病毒RNA提取的返璞归真  

    从血清中提取病毒RNA的试剂盒和方法有很多,从刚开始的TRIZOL提取,到以QIAGEN公司为代表的离心柱提取法,以及新近兴起的磁珠提取法,那么到底哪种方法能够得到最高的提取效率,特别是对于低浓度的病毒的时候?
    
   考虑到离心柱法和磁珠法的原理都是利用二氧化硅在特定条件下吸附RNA,必然有一定的吸附效率和一定的洗脱效率,不可避免的会损失一部分的RNA,导致下游实验检测不到,造成假阴性。为了避免这样的损失,北京百泰克生物技术有限公司从最早的沉淀法开始进行改进和优化,最大限度的提高低浓度病毒的RNA提取效率,并推出了相应的病毒RNA提取试剂盒(RP9001),该试剂盒一经推出就得到了中国CDC和佑安医院的高度认可,以下是佑安医院所做的对比实验,供大家参考(免费索取最新技术资料>> >>)。

 

实验目的:

 

 

HIV-1 RNA提取及下游的RT-PCR实验。

实验材料:

分别采用百泰克公司:Viral RNA isolation Kit 50 perps Cat# RP9001(生产日期:2010-9-5),以及某知名品牌病毒RNA提取试剂盒

本次共检测10例样本,按照百泰克公司试剂盒标准操作程序:

1, 取1.5ml无RNA酶管,分别加入裂解液750ul,Carrier RNA 4ul,病毒样本250ul。室温孵育10分钟,
2, 加入150ul氯仿,室温孵育3分钟。
3, 12000rpm,4℃离心10分钟。
4, 将中层富含RNA液转入另一个新的2.0ml的无RNA酶管中,加入1.2ml 100%乙醇,室温孵育10分钟,12000rpm,4℃离心10分钟。
5, 去掉上清,加入700ul洗液RW,12000rpm,离心1分钟。
6, 去掉上清,加入70%乙醇,12000rpm,离心1分钟。
7, 去掉上清,风干RNA 5-10分钟。等全部干燥后,加入30ul洗脱液,轻弹混匀。
8, 获得的RNA溶液10ul用于HIV-1 耐药检测RT-1 PCR反应。其余冻存与-80℃。
9, RT-PCR步骤略。PCR结果图见下:



同时,我们也用某知名品牌病毒RNA试剂盒对上述中的样品也进行了重复。
操作步骤见标准操作步骤。结果见下图(marker左边):

体会:
总体感觉百泰克公司病毒RNA试剂盒在操作时间上需要大约1小时,完成一次提取。而另一知名品牌病毒RNA提取试剂盒需要0.5小时,时间为百泰克产品的一半。

这一知名品牌病毒RNA提取试剂盒较百泰克公司试剂盒简单,几乎无关键步骤,而百泰克试剂盒中需要提取离心后的富含RNA层液,需要小心,最后风干RNA时需要掌握程度。如果不能充分干燥,将影响下游实验。试验中需要使用氯仿,有刺激性。

从RNA提取效率上看,百泰克病毒RNA提取试剂似乎优于这一知名品牌病毒RNA提取试剂盒,结果见上图。原因分析可能为:1.百泰克试剂标准操作要求样本用量为250ul,而这一知名品牌病毒RNA提取试剂盒仅为140ul;2.这一知名品牌病毒RNA提取试剂盒采用离心柱过滤法,RNA洗脱效率可能不如干燥法。

从价格上看,百泰克公司试剂盒远低于这一知名品牌病毒RNA提取试剂盒。