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反转录酶的新时代

特点一 具有高扩增活性,高热稳定性的反转录酶

  反转录酶,又称逆转录酶,是依赖RNA为模板的DNA聚合酶的统称。美国科学家H.M.Temin和D.Baltimore在1970年发现了反转录酶,并因此获得了1975年的诺贝尔生理学医学奖。反转录酶的发现对遗传工程技术起来到了巨大的推动作用,是研究真核或者原核生物目的基因,构建cDNA文库等实验不可或缺的工具,与Taq酶等共同构成了现代生物技术的的基础工具酶。

   目前已经商品化的反转酶主要有,AMV(avian myeloblastosis virus)和m-mlv(molomey murine leukemia virus)两种反转录酶。AMV来源于禽成髓细胞瘤病毒,最适反应温度在42℃,具有较强的反转录活性和RNase-H活性, RNase H是一种核糖核酸内切酶,它能够特异性地水解杂交到DNA链上的RNA磷酸二酯键,故能分解RNA/DNA杂交体系中的RNA链,从而限制了cDNA的合成长度。 与之对应的m-mlv该酶基因来源于莫洛尼氏小鼠白血病病毒,在具有较强的反转录活性的同时,却具有较低的RNase-H活性,所以它可以获得较长的cDNA片段。因此目前m-mlv应用最广。

  但是这并没有说明m-mlv就是完美的,由于的它的扩增能力有限,一般获得的cDNA片段长度不超过6KB,不足以满足构建cDNA片段,同时该酶的热稳定性较差,50℃时半衰期很短,无法通过提高反应温度克服RNA的二级结构,因此当遇到有复杂结构的RNA时,反转录酶就会从模板上掉下来,反转录失败。如何通过基因工程的方法提高m-mlv的反转录活性,降低RNase-H活性,提高酶的热稳定性,已成为生物公司的研发热点之一。

  有着雄厚研发能力的北京百泰克生物技术有限公司,一直致力于优良性能的反转录酶的研发工作,在不懈的努力下终于在2011年年初迎来了突破性进展。我们经过对m-mlv基因多次定点突变,使该酶的性质得到了质的飞跃!消除了该酶的RNase-H活性,增加了反转录酶与模板的结合能力,增强了酶的延伸活性,从而很到程度上提高了酶的扩增速度,最大可以获得超过15kb的cDNA片段,充分满足了构建cDNA文库的要求;不仅如此,我们研发的反转录酶耐热性显著增强,最适合反应温度50℃,在42℃-55℃范围内拥有最高活性的80%以上,最高反应温度可达60℃,因此可以轻松克服模板RNA的二级结构,顺利完成反转录实验。其性能已经达到行业领先的水平,以下是我们公司与其他公司的反转录酶做的一些对照实验:

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图1 以小鼠总RNA为模板,反转录温度42℃,PCR扩增基因为小鼠Cpt1a基因(1569-3567),a1、a2某知名公司m-mlv,b1、b2百泰克公司m-mlv supermo (200U,货号PR6811),c1、c2百泰克公司m-mlv super III (200U,货号PR6811),d1、d2某知名品牌产品

 


图2以小鼠总RNA为模板,反转录温度50℃,PCR扩增基因为小鼠Cpt1a基因(1569-3567),a1、a2百泰克公司supermo III (200U,货号PR6811,b1、b2某知名公司产品,c1、c2某知名品牌产品


图3以小鼠总RNA为模板,反转录温度55℃,PCR扩增基因为小鼠Cpt1a基因(1569-3567),a1、a2某知名公司产品,b1、b2, 百泰克公司m-mlv supermo III (200U,货号PR6811), c1、c2 某知名品牌产品


 
图4以小鼠总RNA为模板,
以小鼠总RNA为模板,反转录温度50℃,PCR扩增基因为小鼠Cpt1a基因(69-4042 ) ,a1、a2某知名公司产品, b1、b2, 百泰克公司m-mlv supermo III (200U,货号PR6811)c1、c2某知名品牌产品

 

特点二 无细菌核酸污染的新型反转录酶

  常见的反转录酶主要有,AMV(avian myeloblastosis virus)和m-mlv(molomey murine leukemia virus),耐热真菌分泌的翻转酶等,市场上以前两种反转录酶为主。目前这两种商品化的反转录酶都是来源于大肠杆菌表达的重组酶,经过一定的纯化方法后去除了大肠杆菌本身的杂蛋白后制得。虽然蛋白的纯度较高,但是仍会有少量大肠杆菌的核酸污染,当RNA来自真核生物时,由于种系亲缘关系很远,反转录酶中污染的少量大肠杆菌一般不会影响扩增。但是当RNA来自原核生物尤其是肠杆菌属时,由于亲缘关系很近,此时反转录酶中污染的少量大肠杆菌核酸便会导致假阳性扩增,从而对正常的扩增产生致命的影响,很多研究原核RNA反转录和荧光定量的学者们深深地被这个问题困扰着,他们迫切希望能找到一种无大肠杆菌核酸污染的反转酶。

  针对这样的问题,有着雄厚研发能力的北京百泰克生物技术有限公司,经过反复试验摸索,终于开发一套独特的制备反转酶的方法,采用该方法制备的反转录酶中不含有大肠杆菌自身的核酸片段,以此反转录酶为模板,用大肠杆菌16s DNA引物为进行PCR扩增,35个循环后荧光定量仪检测无扩增。从而彻底解决了由于大肠杆菌核酸污染,导致实验无法完成的难题。